双荧光素酶报告基因实验的一些影响因素及注意事项【最新3篇】

双荧光素酶报告基因实验的一些影响因素及注意事项 篇一

在生物学研究中，双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告基因实验是一种常用的方法。该实验通过使用两种不同的荧光素酶来检测靶基因的表达水平，从而研究基因的功能和调控机制。然而，这一实验的结果可能受到多个因素的影响，因此在进行实验时需要注意一些关键因素。

首先，选择适当的基因转染方法对于实验结果的准确性至关重要。常见的基因转染方法包括病毒载体介导的转染、化学药物介导的转染和电穿孔法。不同的转染方法适用于不同的细胞类型和研究目的，因此选择合适的转染方法可以提高实验的成功率。

其次，双荧光素酶报告基因实验中，荧光素酶的稳定性和活性对实验结果的准确性有很大的影响。荧光素酶的稳定性可以通过保存条件和使用期限来保证，而荧光素酶活性则需要在实验过程中注意温度和pH值的控制。此外，注意避免荧光素酶与其他化学物质的相互作用，以免影响实验结果。

另外，实验中选择合适的内参基因也是十分重要的。内参基因是用来校正实验结果的基因，其表达水平应尽量稳定且不受实验条件的影响。常用的内参基因包括β-actin、GAPDH等。在实验中，应根据研究的具体需求选择合适的内参基因，并验证其在实验条件下的稳定性。

此外，实验的数据分析也需要注意一些要点。在双荧光素酶报告基因实验中，通常使用荧光素酶活性比值（比如荧光素酶1的活性/荧光素酶2的活性）来表达靶基因的表达水平。在数据分析过程中，应注意排除掉实验中的扰动因素，比如细胞的毒性、荧光素酶的自发活性等。此外，重复实验的次数也应足够，以保证数据的可靠性和统计学的有效性。

综上所述，双荧光素酶报告基因实验是一种常用的方法，但在进行实验时需要注意一些关键因素。选择适当的基因转染方法、保证荧光素酶的稳定性和活性、选择合适的内参基因以及正确的数据分析方法都是确保实验结果准确性的重要因素。只有在严格控制这些因素的情况下，才能获得可靠的实验结果，进一步深入研究基因的功能和调控机制。

双荧光素酶报告基因实验的一些影响因素及注意事项 篇二

双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告基因实验是一种常用的技术，用于研究基因的功能和调控机制。在进行该实验时，需要注意一些关键因素以确保实验结果的准确性和可靠性。

首先，实验前需要选择合适的质粒载体。质粒载体是用来携带报告基因和靶基因的载体，其选择应根据实验的具体需求和研究目的来确定。常见的质粒载体包括pGL3基因报告载体和pRL-TK内参基因载体。在选择质粒载体时，需要考虑报告基因和内参基因的相互作用以及稳定性等因素。

其次，实验中的细胞类型也是影响实验结果的重要因素。不同的细胞类型对质粒转染的效率和稳定性有所差异，因此在进行实验前需要选择合适的细胞类型。此外，细胞的密度和培养条件也会影响实验结果，应根据细胞的生长特性和实验要求来确定最佳的培养条件。

另外，实验过程中需要注意荧光素酶的稳定性和活性。荧光素酶是用来检测报告基因的表达水平的重要工具，其稳定性和活性对实验结果的准确性有很大的影响。在实验中，应选择高质量的荧光素酶，并严格控制保存条件和使用期限。此外，荧光素酶的稳定性和活性还受到温度和pH值的影响，因此需要注意在实验过程中保持适宜的温度和pH值。

此外，实验中还需要选择合适的内参基因来校正实验结果。内参基因的表达水平应稳定且不受实验条件的影响。常用的内参基因包括β-actin、GAPDH等。在选择内参基因时，需要根据实验的具体需求和细胞类型来确定，并验证其在实验条件下的稳定性。

综上所述，双荧光素酶报告基因实验是一种常用的技术，但在进行实验时需要注意一些关键因素。选择合适的质粒载体、细胞类型和内参基因是确保实验结果准确性的重要因素。此外，保证荧光素酶的稳定性和活性也是十分重要的。只有在严格控制这些因素的情况下，才能获得可靠的实验结果，进一步深入研究基因的功能和调控机制。

双荧光素酶报告基因实验的一些影响因素及注意事项 篇三

双荧光素酶报告基因实验的一些影响因素及注意事项

　　1．报告基因检测受多种因素影响（载体状态、细胞状态、转染量、转染效率、裂解效率、加样精度、检测过程等），因此同批次样品检测值也可能出现浮动。所以实验一般需要做3个或3个以上复孔，并且引入另一个报告基因作为内参。

　　2．细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好；长时间培养后，细胞难裂解。

　　3．双荧光素酶报告基因的载体选择：

　　a)萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的

　　b)海肾荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL-4代载体或自己构建相应的载体。建议海肾载体不使用强启动子（如SV40、CMV），而选用中等强度的启动子（如TK）。

　　4．双荧光素酶报告基因的载体比例：根据实验具体情况调整。建议作一个预实验来调整（萤火虫载体与海肾载体比例分别用1：10、1：20、1：50、1：100），萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。

　　5．最适反应温度：室温（20-22℃）。各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温。

　　6．双荧光素酶反应体积：20ul（细胞裂解产物）-100ul（萤火虫荧光素酶底物）-100ul（海肾荧光素酶底物），底物量可根据实际情况调整，但一定要保证底物过量，不然会造成检测结果出现大的偏差

　　7．细胞裂解产物存放：常温不超过6小时；-20℃一个月；-80℃半年

　　8．裂解产物与底物混合（手动加样）：要求混合快速、混合时间一致，避免荧光素酶衰变的影响。

　　9．发光半衰期：

　　a)单荧光素酶检测试剂盒（E1500），萤火虫荧光素酶的发光半衰期约12min

　　b)双荧光素酶检测试剂盒（E1910），萤火虫荧光素酶的发光半衰期约9min，海肾荧光素酶的发光半衰期约2min

　　10．检测结果

　　检测前应检测孔板或空管的发光值，作为仪器发光背景值，Modulus多功能检测仪的仪器背景值应小于100；

　　样品检测发光值应该远大于仪器背景值，例如10000。如果样品发光值过于接近仪器背景值，说明样品中荧光素酶过少，需要考虑转染量、转染效率、裂解效率等因素。